家蝇抗菌蛋白的分离纯化及部分性质 KSYHPD

苏州无锡双福环保公司专业从事各种水处理设备的生产和销售，长期供应全自动加药装置、直饮水设备、纯水设备等工业水处理设备，公司以“用户至上、质量为本”为经营理念，与您共创美好未来。家蝇抗菌蛋白的分离纯化及部分性质柏鸣周立（四川大学生命科学学院成都610064）通过体壁损伤法诱导家蝇（ Musca domestica）幼虫产生免疫血淋巴，经沸水浴热变性、减压蒸馏浓缩、Seph 家蝇抗菌蛋白的分离纯化及部分性质柏鸣周立（四川大学生命科学学院成都610064）通过体壁损伤法诱导家蝇（ Musca domestica）幼虫产生免疫血淋巴，经沸水浴热变性、减压蒸馏浓缩、Sephadex G 15柱脱盐、CM Sepharose离子交换层析、Sephadex G 50凝胶过滤等步骤，分离得到一种具抗菌活性的蛋白质，并达电泳纯。结果表明，分离物不具血细胞凝集活性，也不是溶菌酶，而是一种未见报道的抗菌蛋白。经SDS自80年代初，从天蚕中分离到抗菌肽并测定其一级结构后，昆虫免疫机制的研究成为一个非常活跃的领域。到目前为止，从鳞翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫中诱导并已纯化的抗菌物质达50多种往的研究多集中在个体较大的昆虫，而家蝇由于个体小，对其免疫机制进行研究存在许多困难。王远程等初步测定了家蝇免疫血淋巴中抗菌物质的组成及部分理化性质，其研究表明，这种抗菌物质是蛋白质。但目前家蝇中抗菌蛋白的分离纯化还未见报道。

我们通过减压蒸馏、离子交换层析和凝胶过滤等步骤，首次从家蝇幼虫中提取分离到了一种抗菌蛋白，并使之达到电泳纯。

1材料与试剂1. 1. 1家蝇来源和饲养虫卵春季取自室外，以麸皮、奶粉、猪血拌匀的人工配合饲料孵化饲养，在室温25 28 e下饲养至3龄虫备用。

供试菌种为本学院微生物教研室提产品，甲叉双丙烯酰胺为Fluca产品，其余试剂均为国产分析纯。

2方法2. 1抗菌物质的诱导用3号昆虫针斜刺幼虫腹腔，一条一针，刺伤后继续饲养36 48 h.

2. 2抑菌活力的测定采用改进的滤纸片法。配制枯草杆菌菌悬液，使其A） .每个平皿倒入约10 mL LB培养基，加入30 LL菌悬液，振摇混匀，冷却后待用。每张滤纸片（ d = 6 mm）上加5 LL样品，在无菌条件下贴于培养基表面， 37 e培养12 h，测定抑菌圈直径以表示抑菌活力。

2. 3家蝇抗菌蛋白的提取和分离血淋巴的提取取幼虫100 g，加入含0. 2巯基乙醇的热处理缓冲液（ 0. 04 mol/ L乙酸乙酸铵缓冲液， pH 3. 6）约100 mL，置电动捣碎机中充分捣碎。匀浆液用高速冷冻离心机离心（ 10 000 g30 min， 4 e ） ，取上清液于沸水浴中搅拌加热10 min，迅速冰浴冷却后再次离心（ 4 000 g30 min， 4 e ） .上清液置 20 e冰箱保存备用。

2. 3. 2血淋巴的浓缩上述反渗透纯净水设备上清液融冻后，置旋转蒸发仪40 e减压蒸馏，浓缩至原来体积的约1/ 10.

mol/ L乙酸铵缓冲液（ pH 5. 1）洗脱除去多余的盐，收集蛋白峰。

离子交换层析平衡，合并脱盐的蛋白峰上柱。用相同缓冲液洗涤，至铵缓冲液（ pH 5. 1）梯度洗脱。分部收集，经280 nm比色和抑菌活性检测，收集有抑菌活性的蛋白峰。

2. 3. 4凝胶过滤活性的部分，经40 e减压蒸馏浓缩后，冷冻干燥。合并几次的样品，溶于少量0. 05 mol/ L乙酸铵缓冲液脱，分部收集，经280 nm比色和抑菌活性检测，收集有抑菌活性的蛋白峰。

2. 4家蝇抗菌蛋白的部分性质2. 4. 1纯度鉴定采用低pH聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE） ，参照文献[ 6]中不连续PAGE的方法。分标准分子量蛋白系统参照文献[ 8]中的方法。

2. 4. 4凝血活性检测参照文献[ 9]中的方法，分别用鸡、鸭、兔血以及人A， B， O型血作检测。

3结果3. 1纯化结果Sepharose（ Fast Flow）柱离子交换层析，洗脱曲线见图1，洗脱液抑菌活性检测见图2.

析的活性部分，上Sephadex G 50柱，洗脱曲线见图3，洗脱液抑菌活性检测见图4.

6期柏鸣等：家蝇抗菌蛋白的分离纯化及部分性质3. 2家蝇抗菌蛋白的部分性质3. 2. 1纯度鉴定样品经PAGE和SDS PAGE，银染结果均表明已达到了电泳纯（图5） .

3. 2. 2分子量测定准蛋白质的分子量，计算出家蝇抗菌蛋白M r= 12 3. 2. 3等电点测定用凝胶等电聚焦法测得家蝇抗菌蛋白的等电点为9. 8（图7） .

3. 2. 4凝血活性检测经凝血活性检测，家蝇抗菌蛋白对鸡、鸭、兔以及人A， B， O型血细胞均无凝集作用。

3讨论与高等动物相比，昆虫有其独特的免疫系统和免疫机制。昆虫的细胞免疫主要是由血淋巴中的浆细胞和颗粒血细胞等包被、吞噬和消化外来异物。而体液免疫则是由血淋巴中存在的各种有关的大分子物质，包括溶菌酶、凝集素、抗菌蛋白或抗菌肽等，配合多功能的血细胞建立的一个开放的完整的防御体系。其中昆虫抗菌蛋白或抗菌肽具有广谱抗菌能力，分子量又较小，正成为新型抗菌药物的研究目标和转基因抗病作物的基因来源。家蝇生活在杂菌丛生的环境中，但自身并不染病，其独特的免疫机制已成为国内外研究的热点。本文首次报道从家蝇中分离纯化出一种抗菌蛋白，这为家蝇免疫系统的进一步深入研究打下了基础。

通过家蝇免疫血淋巴对数种细菌抑菌活力的比较，我们找到了一株较敏感的枯草杆菌，并以之为检测菌株。因为昆虫抗菌蛋白或抗菌肽是非专一的免疫应答产物，不同的诱导源均可诱导昆虫产生抗菌物质[ 10]，我们用针刺损伤体壁的方法即诱导了家蝇抗菌蛋白的产生。由于抗菌蛋白含量甚微，而且用离心法获得的血淋巴含有大量杂蛋白昆虫血淋巴中的抗菌物质多为小分子量蛋白或肽类[ 11]，我们发现用聚乙二醇浓缩后活力有明显降低乃至丧失，这为分离纯化带来较大困难。我们利用大多数抗菌蛋白具有很高热稳定性的特点，通过沸水浴使杂蛋白大部分变性除去。并采用40 e减压蒸馏的方法进行浓缩，浓缩后盐浓度变得较大，再用Sephadex G 15柱脱盐，以使后续的层析分离工作得以顺利进行。

凝集素也是昆虫体液防御机制的组成因子之一，其作用是凝集外来的微生物，并介导血细胞对其包被和吞噬[ 11].昆虫凝集素一般分子量较大，且凝血实验表明这种具有抗菌活性的蛋白质没有凝血活性，所以我们推测它不是凝集素。从其分子量以及热稳定性来看，该蛋白质类似于昆虫溶菌酶。但溶菌酶的等电点一般为10. 5 11. 0，而我们测得该蛋白质的等电点为9. 8.溶菌酶仅对革兰氏阳性菌有作用们在研究中发现，这种抗菌蛋白对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）也有抑制作用。更为重工业纯水设备要的一点是，在抑菌实验中抗菌蛋白表现为抑制细菌生长，而不是使生长的细菌细胞溶解。所以我们推测它不是溶菌酶。综上所述，该蛋白质既不是凝集素，也不是溶菌酶，而是一种抗菌蛋白。它究竟属于已有的抗菌蛋白种类，或者是一应用与环境生物学报7卷种全新的昆虫抗菌蛋白，以及它的其他方面的性质，还有待氨基酸组成、序列测定、结构分析等进一步的研究。

5黄自然，郑庭辉，梁怡章，屈贤铭。柞蚕抗菌肽的抑菌效6何忠效，张树政主编。电泳。北京：科学出版社， 1990. 36 7夏其昌主编。蛋白质化学研究技术与进展。北京：科学出8陈曾燮等编。生物化学实验。合肥：中国科学技术大学出9孙册等编。凝集素。北京：科学出版社， 1986. 20 21 6期柏鸣等：家蝇抗菌蛋白的分离纯化及部分性质

水处理设备产品 快速导航链接>>>反渗透设备| 软化水设备| 海水淡化设备| 全自动加药装置| 变频供水设备| 中水回用设备| 过滤设备| 直饮水设备| EDI超纯水设备| 超纯水设备| 超滤设备| 循环水设备