防治烟草黑胫病的根际细菌分离与筛选 KSYHPD

苏州无锡双福环保公司专业从事各种水处理设备的生产和销售，长期供应全自动加药装置、直饮水设备、纯水设备等工业水处理设备，公司以“用户至上、质量为本”为经营理念，与您共创美好未来。防治烟草黑胫病的根际细菌分离与筛选顾金刚方敦煌李天飞刘杏忠从云南昆明、玉溪、曲靖、楚雄、大理等地13份烟田根际土样中，经分离纯化得到753株根际细菌。通过对黑胫病病原（ Ph ytophthora 防治烟草黑胫病的根际细菌分离与筛选顾金刚方敦煌李天飞刘杏忠从云南昆明、玉溪、曲靖、楚雄、大理等地13份烟田根际土样中，经分离纯化得到753株根际细菌。通过对黑胫病病原（ Ph ytophthora parasitica. var. nicotiana ）的平板拮抗筛选，共得到有抑制病原菌生长的根际细菌97株，用细菌悬液浸泡烟草种子，通过测定烟草种子发芽率和对烟草苗期的促生作用，选出有较好促生作用的细菌19株，再进行温室盆栽测定，选出对烟草黑胫病有防病促生作用的根际细菌6株，分别编号为RB1、R4、RB42、RB59、RB78、RB89.在研究过程中发现，从明胶、几丁质培养基和从根表上分离到的细菌，其工业纯水设备防病促生作用的机率较高。在防治苗期黑胫病的温室试验中， RB42和RB89菌株的相对防治效果分别达到42. 22和37. 78.通过形态学与生理生化初步的鉴定， RB42、RB78、RB89鉴定为假单胞杆菌（顾金刚，男， 27，硕士，研实，中国农科院土肥所，北京海淀区中关村南大街12号，北京， 100081方敦煌，李天飞seo优化，云南烟草研究院农业所，玉溪， 650刘杏忠，中国农科院生防所，北京， 100081烟草是我国重要的经济作物，也是病害危害*严重的作物之一，从播种到收获，整个过程都可受到病原物的侵染，而引起侵染性病害。黑胫病是我国烟草生产危害严重的老病害，除东北烟区零星发生以外，包括台湾省在内的华南、华中、华东和西北烟区均普遍发生。

据1989～1992年， 15省调查统计，黑胫病每年造成的直接经济损失，折合人民币大约2. 1亿元。

在植物根际存在着大量微生物，其中尤以细菌的种类*多，数量也*大[1 ].根据根际细菌对植物不同作用分为有益、中性、有害3种类型，其中，有益根际细菌[2 ].现有23个属的细菌被发现有生防潜力，应用于多种作物的生物防治PGPR在烟草上应用研究鲜有报道，为此，我们对烟草PGPR菌株进行了分离和筛选。

1材料与方法1. 1供试材料1. 1. 1土样分别从云南的昆明、玉溪、楚雄、曲靖和大理等地烟田采集根际土样13份。

1. 1. 2烟种红花大金元、云烟85和K326（云南省烟草科学研究所育种室提供）。

nicotiana （云南省烟草科学研究所高新室方敦煌提1. 2试验方法1. 2. 1根际细菌的分离称取1g根际土，加入玻璃珠、吐温、石英砂振荡和研磨根段，采用平板涂布法分离外根际、根表和内根际的细菌。

1. 2. 2根际细菌的筛选先采取平板拮抗和促发芽筛选出一部分菌株，然后进行钵栽温室促生和抗病筛选，具体方法见参考文献[2， 5， 6].

1. 2. 3拮抗菌株的鉴定革兰氏染色采用3 KOH鉴定其余按常规方法进行2结果与分析2. 1根际细菌的分离从云南昆明、玉溪、曲靖等地烟田采集土样13份，采取在不同培养基上、不同分离部位的分离方法，挑取不同类型的细菌菌落，纯化后得753株根际细菌。在分离根际细菌时发现，烟株根际有大量的根际细菌，其含量可达10 cfu /g根鲜重，不同地区的土样分离的根际细菌类型和种类数量有较大差别（表1）。

顾金刚等防治烟草黑胫病的根际细菌分离与筛选2. 2拮抗菌株的筛选2. 2. 1平板拮抗筛选经过平板拮抗筛选，共得到97株细菌。其中，从根表、且抗80℃高温中（ SB）筛选到的细菌量*大，占23. 71 ，其次是根表（ SN ）占18. 56.但从筛选到拮抗菌株的效率来看，*高的为明胶培养基从根表（ SG）筛选到的细菌的效率*高，为23. 53 ，其次为几丁质培养基从根表（ SC）筛选到的细菌效率，为22. 50 ，*低的为从外根际（ PN）筛选SG、PG上筛选到细菌的平均效率为18. 70 ，从SB、SN、PN、E上筛选到细菌的平均效率为11. 20 ，从上筛选到细菌的效率要比从SB、SN、PN、E上筛选到细菌的效率高出7. 50个百分总计福兴办事处牟定新桥有家1玉溪黄草坝1玉溪黄草坝2大理祥云马街棕棚晋宁昆阳大理三哨曲靖大理祥云下庄鱼进所牟定新桥有家2牟定楚雄路边牟定共和青波祥云沙龙芮家总计福兴办事处牟定新桥有家1玉溪黄草坝1玉溪黄草坝2大理祥云马街棕棚晋宁昆阳大理三哨曲靖大理祥云下庄鱼进所牟定新桥有家2牟定楚雄路边牟定共和青波祥云沙龙芮家总计2. 2. 2钵栽防病筛选通过根际细菌对烟草苗期的促生试验共得到具有较好促生作用的菌株26株，其中对红花大金元、K326、云烟85 3个烟草品种都有明显促生作用的菌株2株。通过发芽率试验及防病促生试验筛选出19株较好的细菌做进一步试验。

2. 2. 3病土盆栽促生筛选经过多次盆栽试验，筛选到促生较好的根际细菌6株。其中对叶面积促生达极显著水平的有2株，对株高促生达极显著水平的有1 2. 2. 4温室防治黑胫病的试验结果温室抗病盆栽试验，菌株对黑胫病有一定的防效， RB42、RB89对病害的相对防效达到了42. 22和37. 78 （表4）。

2. 2. 5菌株鉴定结果鉴定菌株的菌落形态是规则圆形、表面光滑，菌体皆为杆状（表5） ，生理性状（表6）。综上，我们将RB42、RB78和RB89分别鉴定为假单胞杆菌属（ Pseudomonas spp） ， R4鉴定为芽孢杆菌株叶面积（ cm平均值 ：方差分析采用LSR法菌株接种株数15d死亡株数发病率（ ）病情指数相对防效（ ）菌株菌落颜色菌体大小（μm）革兰氏染色鞭毛着生位点、根数运动性可溶性色素黄白色端生1根鞭毛褐色乳白色侧生1～2根鞭毛无青灰色端生1～3根鞭毛荧光黄色端生1～2根鞭毛无青黄色端生1～2根鞭毛褐色青色端生1～2根鞭毛荧光厌养生长氧化酶葡萄糖氧化发酵葡萄糖产气脓青素检出试验阳性试验阴性ND未做顾金刚等防治烟草黑胫病的根际细菌分离与筛选3讨论从不同作物根际分离筛选出对作物有益的根际细菌，一直是生防学家感兴趣的研究课题。由于根际微生态系统的复杂性，从作物根际筛选根际细菌，并施用于作物根部是生防研究的一条捷径。Barry认为，生防因子极有可能的首要条件是能够在根际和根表的植物和微生物的相互作用中胜任生态安全。

我们采用从烟草根际不同部位、不同培养基上分离的方法，通过平板拮抗试验、发芽率测定、多次的温室盆栽测定筛选有益菌株。从分离、筛选的结果看到，产明胶酶和几丁质酶的菌株对病原菌抑制机率较高，从根表分离到的细菌防病促生作用的机率较高，这为以后的PGPR分离、筛选提供了依据。Wong和Baker研究表明，活体条件下荧光假单胞杆菌（ Pseudomonas graminisvar. tritici）的抑制作用和离体条件下的拮抗作用无一定的相关性[ 10 ].王春霞等在分离、筛选棉花时，也发现有此现象[11 ].我们在烟草上分离、筛选PGPR时也发现：在平板上拮抗活性较强的菌株，在温室盆栽时的防病效果不是*好的。由此认为，菌株产生抗生素类物质仅是菌株防病的一种机制，而对于某些菌株而言，可能就有多种机制在共同起作用，只不过起主导作用的防病机制不同罢了。Sch roth和认为，抗生素或嗜铁素（ Siderophorese）的产生似乎是许多假单胞杆菌抑制根病和苗病的重要特征[12 ].我们的筛选结果，通过菌株鉴定，在这6株菌株中，有3株为假单胞杆菌，其中2株发荧光，占有较大的比例，这与大多数的研究报道一致。

根表是根际效应*强烈的部位，根表也是防止病原菌侵入的*后屏障，根表微生物的相互作用，在某种程度上决定着植物的感病和抗病。在我们的研究中发现，根表区域的根际细菌的种类和数量要多于外根际，从根表分离到有益菌的机率较大，因此对于作用机制是产生抗生素或者竞争营养和空间位点的生防菌株来说，根表是实施生防的重要部位。

3郭荣君。拮抗大豆根腐病和大豆胞囊线虫根际细菌研究。

硕士学位论文。 1996.

4李长松。拮抗性细菌生物防治植物土传病害的研究进展。

5崔云龙，等。短小芽孢杆菌D82对小麦根腐病原菌拮抗的6刘杰贤、戚洪全。荧光假单胞菌防治甜菜立枯病实验研究。

7方中达。植病研究方法。第三版，北京：中国农业出版社，8中国科学院微生物研究所分类组。一般细菌鉴定方法。北京：科学出版社， 1978.

11王春霞。棉花PGPR菌株的分离、筛选、鉴定、作用机制及其分子生态学的研究。博士论文， 1997.

[英文摘要见45页] [正文见22页]刘晓杰等烟草行业应用信息系统技术框架研究与分析

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